小分子藥物靶點鑑定及驗證

現代藥物發現和開發過程中，藥物靶點和作用方式仍然是最大的兩個挑戰。正確的藥物作用靶點不僅關係到藥物的效力和特異性，還涉及到藥物安全性和潛在的副作用問題。藥物靶點是指藥物與機體內生物大分子的直接結合部位，主要包括受體、酶、離子通道、轉運體、核酸等生物大分子。鑑定藥物作用的靶點對於新藥的設計極為關鍵，它可以幫助我們理解藥物的作用機理，建立藥物活性與生物學功能之間的聯絡，預測可能的副作用和耐藥機制，以及發現新的治療靶點。透過靶點鑑定，可以確保藥物研發過程的高效性和藥物上市後的安全性。

新的藥物作用靶點是一系列新藥發現的突破口，尋找藥物作用的新靶點已成為當今創新藥研發激烈競爭的焦點。從藥物開發角度來看，藥物的效果很大程度上取決於它的作用靶點。目前主要使用兩種藥物發現策略：基於表型的藥物發現和基於靶標的藥物發現。基於表型的藥物發現根據現有的藥理學，在細胞、組織或器官中篩選小分子或多肽。基於靶標的藥物發現首先涉及確定靶標，然後識別活性分子。隨著分子生物學的快速發展，基於靶標的藥物發現正規化取代了傳統的基於表型的方法，因為它可以提高篩選能力並定義合理的藥物發現方案。

酶作為藥物靶點

百泰派克生物科技（BTP）依託高分辨質譜平臺，結合親和層析技術以及活性位點定向探針技術，開發並驗證了多種基於靶標的小分子藥物靶點鑑定平臺，為您提供分子間相互作用鑑定全流程科研服務，包括蛋白-蛋白互作（PPI）、蛋白-小分子藥物互作，可以準確地識別和驗證小分子藥物的作用靶點，助力創新藥物的發現和開發。百泰派克生物科技基於靶標的小分子藥物靶點鑑定方案包括：

1.基於ABPP策略的小分子藥物靶點鑑定及驗證

基於活性的蛋白質分析（Activity-based protein profiling，ABPP）將基於活性的探針和蛋白質組學技術結合在一起，用於識別小分子的蛋白質靶標，甚至靶蛋白的活性位點。ABPP 利用由兩個元素組成的活性位點定向化學探針：1）活性位點定向反應基團，用於結合和共價標記催化相關酶的特定子集（或家族），以及 2）報告標籤（例如，熒光團、生物素、炔烴或疊氮化物）用於檢測/定量和/或富集/鑑定標記的酶。原則上，小分子的活性基團直接與目標蛋白和報告基團相互作用，以利於目標捕獲。根據所選的報告組，可以進行不同的後續實驗。例如，熒光基團可用於快速凝膠篩選和鑑定細胞或動物中小分子的定位，生物素可用於蛋白質富集，然後透過質譜檢測來鑑定目標蛋白質。

Front Pharmacol. 2018 Apr 9;9:353.

基於活性的蛋白質分析工作流程

服務內容

技術優勢

1）特異性：透過特定活性探針針對性地標記活躍的酶類，高度特異的識別活性蛋白質；

2）功能性分析：能夠直接評估蛋白質的酶活性狀態，而不僅是其表達量或結構變化；

3）實時監測：可以在細胞內的生理條件下監測酶的活性，捕捉藥物的即時影響；

4）非侵入性標記：探針與蛋白質的共價結合是非侵入性的，不會干擾其正常功能，保持了生物樣品的生理真實性；

5）樣品適用性：ABPP技術可用於細胞裂解物、活細胞、動物裂解物，甚至活體動物。

2.基於TPP策略的小分子藥物靶點鑑定

熱蛋白質組分析（thermal proteome profiling，TPP ）旨在全面瞭解小分子化合物與蛋白質的相互作用。其核心原理是基於一個事實：受熱時的蛋白質會變性並變得不溶。蛋白質可以在與小分子（例如藥物或代謝物）、核酸或其他蛋白質相互作用或翻譯後修飾時改變其熱穩定性。TPP使用基於多重定量質譜的蛋白質組學來監測數千種表達蛋白質的熔解曲線。重要的是，這種方法可以在體外、原位或體內進行。TPP已成功應用於識別藥物的靶標和脫靶、研究蛋白質-代謝物和蛋白質-蛋白質相互作用、識別代謝物結合蛋白以及繪製與不同核苷酸相互作用的蛋白質圖譜。

Nat Prod Rep. 2016; 33(5):719-730.

基於TPP策略的小分子藥物靶點鑑定工作流程

服務內容

技術優勢

1）全域性性和非偏倚性：可以在全蛋白組水平上，無偏倚地探索小分子與蛋白質的相互作用；

2）細胞內作用分析：可在細胞的生理環境中捕捉真實的藥物-蛋白質相互作用，反映藥物的實際作用；

3）定量性：可提供關於藥物-靶標相互作用強度和穩定性的定量資訊；

4）資料可靠性：TPP可以同時在多個溫度點上進行，因此可以減少因實驗設定導致的偏差，提高資料的可重複性和可靠性。

3.基於LiP-MS策略的小分子藥物靶點鑑定

限制性酶解-質譜分析（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）結合蛋白質限制性酶解和質譜分析的技術，利用特定條件下蛋白酶對蛋白質進行有限度的切割生成的蛋白片段進一步透過質譜分析鑑定。在小分子藥物靶點鑑定過程中，將小分子藥物與其潛在的蛋白質靶點進行孵育，藥物分子與蛋白質結合後會引起蛋白質構象的改變，這種改變會影響到蛋白質的酶解模式。透過比較藥物處理和未處理條件下蛋白質的酶解片段，可以識別出與藥物相互作用的蛋白質區域，進而推斷出藥物的作用靶點。這對於藥物機制的解析和新藥發現具有極其重要的意義，尤其是在有針對性地設計藥物分子和最佳化藥物效能方面。

Piazza, et al. 2018, Cell 172, 358-372.

基於LiP-MS策略的小分子藥物靶點鑑定工作流程

服務內容

技術優勢

1）高通量和高靈敏度：LiP-MS能夠分析數千個蛋白質樣本，即使是那些低丰度的蛋白質靶標也能被鑑定出來；

2）無需先驗知識：這種方法不需要關於潛在靶點的預先資訊，可以在廣泛的蛋白質中發現未知的藥物作用點；

3）體外和體內適用性：LiP-MS既可以在體外進行，也可以在體內應用，可提供更多關於藥物如何與靶標相互作用的資訊；

4）結構動態性分析：LiP-MS可以提供小分子與蛋白質結合後蛋白質結構變化的動態過程。

4.基於DARTS策略的小分子藥物靶點鑑定

藥物親和致靶點穩定性（Drug affinity responsive target stability，DARTS）是一種識別小分子的潛在蛋白質靶點相對快速且直接的方法，它依賴於透過與小分子相互作用而賦予靶蛋白免於蛋白水解的保護。DARTS 透過簡單地用感興趣的化合物和載體對照或無活性類似物處理細胞裂解物的等分試樣，然後用蛋白酶對細胞裂解物中的蛋白質進行有限消化來進行。然後透過 SDS-PAGE 分離樣品並染色，以鑑定免受小分子蛋白水解的蛋白質條帶。最後使用質譜（MS）來鑑定每個條帶中存在的蛋白質。這種無偏見的方法已成功用於識別天然產物和其他生物活性小分子的新蛋白質靶標。